Обзор прессы

01.03.09

ОТДАЛЕННЫЕ ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ТЕХНОЛОГИЙ ЛЕЙКОФИЛЬТРАЦИИ КРОВИ

ВЕСТНИК СЛУЖБЫ КРОВИ РОССИИ, № 1, март 2009

СООБЩЕНИЕ 2.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЗМЫ ДОНОРСКОЙ КРОВИ

В. В. Лаптев, И. Э. Байрамалибейли, Л. В. Персанова, Э. Л. Салимое, О. В. Новоселова

ФГУ «Учебно-научный медицинский Центр Управления Делами Президента РФ»,
Российский научный центр хирургии РАМН, ФГУ "Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов»


В нашем 1-ом сообщении (Лаптев В. В., 2008) была затронута тема леикофильтрации в качестве возможного пути достижения не только уменьшения количества лейкоцитов, но и вирусредукции, что делает технологию леикофильтрации незаменимой.

Продолжая начатую тему, важно отметить другие преимущества фильтрационных технологий по обеспечению качества и безопасности получаемой продукции, в частности, перед аппаратными методами получения компонентов крови.

Прежде всего, следует подчеркнуть, что аппаратные методы не способны обеспечить глубину лей-коредукции до 4 log. Поскольку уровень содержания патогенов и биоактивных веществ находится в определенной зависимости от конечной концентрации лейкоцитов — перспектива остается за методом леикофильтрации. Данную точку зрения отстаивают многие клиницисты. В частности Н. J. Nielsen, 2006, суммируя результаты исследований различных авторов, информирует, что внедрение универсальной леикофильтрации позволило улучшить конечные показатели лечения и уменьшить число побочных эффектов. Просматривается связь между синдромом иммуномо-дуляции и инфекционными осложнениями, возникающими на фоне гемотрансфузионной терапии. Отсутствие инфекционных осложнений в постоперационном периоде, с другой стороны, является благоприятным признаком стойкости ремиссии у больных, оперированных по поводу рака.

Для достижения лучших результатов, как считают J. H. Hammer et al., 1999, Т. Mynster et al., 1999, важно, чтобы лейкофильтрация крови проводилась как можно раньше, в первые часы после заготовки. В этом случае иммуномодулирующее действие биоактивных веществ не проявляется. Ранее к подобным выводам привели клинические исследования, выполненные в 43 Европейских госпиталях (G. Sirchia et al., 1994).

Программа универсальной лейкоредукции эрит-роцитной массы на 14 786 пациентах, оперированных на сердце, выполнена в 23 госпиталях Канады. Обобщение результатов показало снижение риска летальности как и эпизодов лихорадки, уменьшение количества применяемых антибиотиков (Р. С. Hebert et al., 2003).

О перспективах применения технологий леикофильтрации свидетельствует тот факт, что на сегодня большинство стран Европы применяют универсальную лейкоредукцию компонентов крови, включая свежезаготовленную плазму (Н. J. Nielsen, 2006).

Методом афереза заготавливается в России не более 6 % компонентов крови, преимущественно плазмы. В будущем данный метод может применяться не более чем в 25—35 %. Остальная кровь, преимущественно заготовленная на выездах, будет перерабатываться ручными методами, включая и лейкофильтрацию.

Особо следует отметить, что в условиях внедрения технологий вирусной инактивации, процедура лейкофильтрации останется для удаления биоактивных веществ и снижения опасности иммунизации реципиентов антигенами лейкоцитов.

Не умаляя достоинств методов афереза — хорошая переносимость процедуры, включая скорость заготовки, достижение стандартных условий выполнения процедуры и качества получаемых компонентов, имеются обстоятельства, которые нельзя не учитывать.

На практике аппаратные методы позволяют достигать глубину лейкофильтрации при процедуре плазмафереза до {10—5)*10--6 л (С. Н. Кононенко, 2007), что никак не соответствует минимально допустимому количеству лейкоцитов 1 ■ 10 , установленному международными требованиями по безопасности для эритроцит- и тромбоцитосодержащих компонентов. Необходима дополнительная процедура лейкофильтрации, в том числе, если плазма в дальнейшем предназначена не только для клинического применения, но и согласно Европейской Фармакопеи, для ее фракционирования на препараты.

Процедура афереза для доноров плазмы может выполняться повторно через 2 недели, всего за год до 20—23 процедур. Одним из побудительных мотивов необходимости реализации интенсивных программ плазмафереза является показатель рентабельности работы аппарата, для чего ежедневная нагрузка на аппарат должна составлять не менее 6 доноров. В этом случае требуется усиление контроля за состоянием доноров, проведение дополнительных исследований.

Имеются данные (А. А. Козлов и соавт., 2008), что проведение многократных цита- и плазмаферезов требует полного исследования системы гемостаза до процедуры и динамического контроля в процессе их выполнения.

Интенсивный аферез требует введения контроля обмена железа у доноров (Ю. С. Суханов и соавт., 2008, Т. Д. Селезнева и соавт., 2008, М. Furuta et al., 1999) и осуществлять железопрофилактику кадровых доноров.

Указанные предложения рано или поздно придется реализовывать, что скажется на удорожании аппаратных процедур заготовки крови.

Исходя из экономической целесообразности, например во Франции, заготовка тромбоцитов от одного донора в 2007 г. против 2006 г. сокращена на 14,8 % (С. А. Оприщенко и соавт., 2008).

Это означает, что объемы заготовки цельной крови в России в будущем вряд ли снизятся и преодолеют 60 % барьер. В связи с этим лейкофильтра-ционные технологии останутся, но будут совершенствоваться.


Уже сегодня очевидно, что реализуемые фирмами устройства для лейкофильтрации отличаются по своим функциональным свойствам и биосовместимости с компонентами крови.

Интерес представляет влияние лейкодеплеции на гемостатический потенциал донорской плазмы. Исследованиями Т. В. Кузьминой и соавт., 2008 показано, что ФУ «Лейкосеп», выпускаемый в России, не оказывает влияния на гемостатический потенциал плазмы. ФУ «Leukofrap WB» увеличивает активность основного физиологического антикоагулянта — антитромбина III. ФУ «Leukoflex» вызывает умеренное снижение гемостатического потенциала плазмы.

Зарубежными исследователями поставлена задача достижения лейкоредукции ниже уровня 4 log Сегодня он достигается на базе новой генерации лей-кофильтров на основе материалов из полиэстеров (A. Hiromichi et al., 2003).

Развивается направление создания полифункциональных лейкофильтров, способных удалять биоактивные вещества и патогены (L. Gregori et al., 2004). Авторами показано,. что применение стандартных лейкофильтров позволяет удалять до 42 % от общего количества патогенов в крови. В настоящее время разрабатываются, в частности фирмой Pall, лейко-фильтры, обладающие способностью связывать при-оны. Проведены предварительные их испытания на зараженных почесухой 120 хомяках, контроль присутствия вируса осуществлялся методом Westem-blot. Количество удаленных вирусов составило 3,7 log При переливании профильтрованной (ранее инфицированной) крови 35 интактным животным, ни в одном случае не произошло заражения.

Т. Burnof et al., 2003 сообщает о результатах испытаний фильтров на основе полимерных пленок, имеющих поры размером 75 nm и 35 nm. Фильтрация HCV-позитивной плазмы через указанные пленочные материалы под давлением около 1 bar, способствовала достижению не только лейкоредукции, но и удержанию HCV вирусов. Превращение HCV-позитивной плазмы в НСV-негативную подтверждено исследованием RNA-полимеразной цепной реакцией (PCR) и количественным методом исследования b-с DNA. Однако следует отметить, что процедура фильтрации дозы плазмы в этом случае занимает более 4 часов, требуется получение весомых доказательств соответствия конечного продукта международным стандартным требованиям по качеству, производственным и технологическим условиям работы учреждений службы крови.

Применительно к затронутым вопросам, нами выполнены собственные исследования, главной целью которых явилось сопоставление ряда функциональных показателей, достигаемых при лейкофильтрации и ап­паратных методах получения компонентов крови.

Материалы и методы исследования

Исследовались образцы плазмы, полученной методами афереза и центрифугирования у 50 доноров крови. Применялись технологии лейкоредукции с использованием фильтрующих устройств (ФУ), встроенных в систему полимерных контейнеров для сбора крови (ФУ «Leukotrap WB», Pall, Германия) — 10 шт., ФУ «УЛЛ-01», ФУ «Лейкосеп» ЗАО НПП «Интеро-ко», Россия — по 10 шт. каждого, аппараты «Haemon-etics» с протоколами работы FFP и РРР.

Контроль факторов гемостаза, противосверты-ваюшей системы и системы фибринолиза выполнен у 50 доноров. Исследования проводились на коагуло-метрах Амелунг КС4, Минилаб 704, спектрофотометре Эппендорф с использованием реактивов НПО «РЕНАМ».

Концентрация миелопероксидазы (МПО) оценивалась с помощью наборов МРО Enzyme Immu-noassay Test Kit (США) в 45 образцах плазмы доноров крови.

Оценка остаточного содержания лейкоцитов при различных режимах центрифугирования (от 2000 до 5000 g в течение 10 минут) на центрифуге Sorvall RT6000 выполнялась на образцах нативной плазмы 5 доноров, полученной из консервированной крови методом центрифугирования при 100 g и продолжительности 15 минут.

Подсчет остаточного количества клеток осуществлялся по специальной технологии с помощью камеры Nagiottae (AABB, 2006 г.), а также автоматического култера Beckman AsT Diff.

Результаты исследований и их обсуждение

Показатели гемостаза плазмы, полученной различными методами, представлены в табл. 1.

Показатели гемостаза при различных методах получения плазмы и применения технологий лейкоредукцин

Таблица 1.

  Норма            
  УЛЛ-01  Лейкосел   Leukotrap WB FFP  РРР 
Протромбин, %   70-120  86,8 ± 12,2  87,2 ± 12,8  91,3 ± 13,1  88,3 ±  12,2   87,4 ± 12,0
Фибриноген, г/л   1,8-3,5   2,1 ± 0,5   2,4 ± 0,6   3,1 ± 0,6   2,4 ± 0,55   2,3 ± 0,6
Фактор V, %   70-120  80,3 ± 14,0  90,1 ± 19,0  88,7 ± 18,0  96,9 ± 16,0  96,4 ± 18,1
Фактор VIII, %   70-150  87,4 ± 19,0  89,4 ± 21,0  90,3 ± 20,0  99,4 ± 19,0  98,0 ± 17,6
Антитромбин III, %   70-120  88,1 ± 12,8  97,3 ± 13,2   89,2 ± 17,0  88,3 ± 13,4  88,2 ± 14,4
Протеин С, %  70-120  80,4 ± 12,0  81,4 ± 11,8  87,4 ± 12,7  88,4 + 12,4  81,2 + 12,3
Плазминоген, %  70-140  90,7 ± 13,0  92,3 ± 12,2  93,6 ± 14,0  93,1 ± 13,0  91,3 ± 12,8


При анализе свертывающей системы в донорской плазме после фильтрации с помощью фильтров УЛЛ-01, Лейкосеп, Leukotrap WB, а также аппаратной плазме при реализации протоколов FFP и РРР статистически достоверных изменений не выявлено.

 

Рисунок. Влияние режимов центрифугирования на остаточное содержание лейкоцитов в плазме донорской крови

Активность фактора VIII в группе Лейкосеп составила 90,1 ± 19,0 %. Относительное превышение содержания VIII фактора в аппаратной плазме 99,4 +-± 19,0 % - протокол FFP и 98,0 ± 17,6 % — протокол РРР, объясняется меньшим разведением плазмы антикоагулянтом — 1:16,0 против 1:8 в группе Лейкосеп. Полученные данные соответствуют результатам исследований других авторов (С. Н. Кононенко, 2007).

В таблице 2 суммированы результаты присутствия в плазме биологически активных веществ при различных технологиях их получения. Контроль осуществлялся за изменением содержания МПО. В исходной плазме, полученной из цельной лейкоредуци-рованной крови, лейкофильтрованной плазме после фракционирования консервированной крови методом центрифугирования и аферезной плазме, полученной по протоколам FFP и РРР. Активность МПО составила 140 ± 12,0; 186 ± 11,6; 189 ± 14,0 и 190 ± ± 13,0 нг/мл соответственно. После процедуры замораживания и оттаивания этих видов плазмы содержание миелопероксидазы существенно возросло в III и увеличилось в IV группе, р < 0,05, против исходных показателей.

Таблица 2

Динамика активности миелопероксидазы в плазме крови человека при различных технологиях ее получения и обработки

Биоактивные вещества   До замораживания Плазма, освобожденная от лейкоцитов, заморож./оттаян. 
 Миелопероксидаза, нг/мл  I  II  III  IV  I  II  III  IV
 140 ± 12,0  186 ± 11,6  189 ± 14,0 190+ 13,0   161 ± 13,0  240 ± 12,8  503 ±  26,0*  280 ± 17,0*

 Примечание:

I — плазма, выделенная из цельной лейкоредуцированной крови;
II - лейкофильтрованная плазма после фракционирования консервированной крови методом центрифугирования;
III — аферезная плазма, протокол FFP;
IV - аферезная плазма, протокол РРР.


Подобные результаты получены впервые. Возникает вопрос, каковы же механизмы увеличения МРО?

Для получения ответа проведены исследования по выяснению влияния режимов центрифугирования на сохранность лейкоцитов, присутствующих в плазме. Диапазон оборотов центрифуги составил от 100 до 5000 g. Результаты суммированы на рисунке. Видно, что по мере возрастания гравитационной силы содержание лейкоцитов уменьшается, достигая 30 % от исходного уровня к 5000 g. Потери лейкоцитов определяли путем подсчета клеток в образцах плазмы для каждого режима центрифугирования. Пробы для подсчета плазмы брали сразу после центрифугирования и встряхивания содержимого пробирок при помощи IKA-VIBRAX-VXR.

Уменьшение содержания лейкоцитов, наиболее вероятно, происходит по двум причинам.

Во-первых, часть клеток разрушается. Об этом свидетельствует динамика статистически достоверного увеличения МРО со 150 ± 11,0 нг/мл при 100 g до 290 ± 15,0 нг/мл при 5000 g, p < 0,05.

Во-вторых, определенная часть лейкоцитов не учитывается при подсчете, поскольку последние, взаимодействуя с тромбоцитами, образуют микроагрегаты. Исследование мазков осадков, полученных при центрифугировании плазмы, подтверждает это предположение. Размеры микроагрегатов варьируют от 15 до 80 мкр.


В их образовании участвуют тромбоциты и преимущественно сегментоядерные лейкоциты, поскольку в гемограмме мазков (ГМ) осадков содержание лимфоцитов преобладает:

ГМ при 2000 g: с - 28 %, лф - 70 %, мон - 2 %;

ГМ при 5000 g; с - 10 %, лф - 90 %. Встречается много деформированных, разорванных и голоя-дерных клеток.

При выборе технологий получения компонентов крови не последнюю роль для учреждений службы крови имеют стоимостные показатели (табл. 3). В таблице представлены сравнительные данные суммарных затрат на приобретение расходных материалов и количество получаемых компонентов за одну процедуру.

 

Таблица 3.
 Применяемая технология Количество получаемых компонентов за 1 процедуру  Расходные материалы Суммарная стоимость работ
 Контейнеры для крови Комплект к аппарату  Лейкосеп   Лейкофильтр ATS-BS
 3-ые  4-у конс.SAGM
 Центрифугирование, лейкофильтрация  3  171-256  371-459  -  360  200*  760-800
 АФЕРЕЗ

 Haemonetics

MCS+

 

Trima

 1

лейкоредукция плаза

-

   комплект  -  -  1900



Видно, что метод простого центрифугирования имеет по этим критериям определенные преимущества. В целом общая стоимость на получение 3-х компонентов за 1 процедуру составляет 760—800 руб. Затраты на аппаратных методах варьируют от (900 до 13 260 рублей, не считая затрат на приобретение соответствующей аппаратуры стоимостью от 1,2 до 2,0 и более миллионов рублей.

Таким образом, результаты работы свидетельствуют о том, что технологии получения компонентов крови методом центрифугирования цельной крови в сочетании с лейкофильтрацией сохраняют на сегодня и на будущее твердые позиции. Они обеспечивают высокие стандартные требования по качеству и последующую клиническую эффективность, являясь максимально доступными по экономическим параметрам и технологическим возможностям их реализации.


 


Резюме: Представлена сравнительная характеристика существующих технологий получения плазмы. Минимальное содержание биологически активных веществ (миелопероксидазы) выявлено в плазме, выделенной из цельной лейкоредуцированной крови. Затраты на реализацию этого метода в 2,5—12 раз меньше, нем на аппаратные методы (Haemonetics, MCS+, Trima).

Abstract: The comparative characteristic ofexsting technologies of reception of plasma is presented. The minimal maintenance bioactive substances (Myeloperoxidase) is revealed in the plasma allocated from whole blood, leukocyte depleted. In 2,5—12 times it is less than expense for realization of this method, than aphresis methods.

 

      Список литературы

      1. Козлов А. А., Качалова Н. Д., Невская К. Н., Простакова Т. М., Система гемостаза и многократный цита- и плазмаферез.Вестник службы крови России, № 2, 2008, стр. 27-30.
      2. Кононенко С. Н. Обеспечение качества и безопасности полученной аферезом свежезамороженной
плазмы в военно-медицинском учреждении. Автореферат канд. диссертации, С.-П., стр. 8—10.
      3. Кузьмина Т. В., Садков С. А., Пучкова 3. В. и др.. Влияние лейкодеплеции на гемостатический потенциал донорской плазмы. Вестник службы крови России, № 2, 2008, стр. 8-10.
      4. Лаптев В. В., Шишов Н. М., Кюрегян К. К.
Отдаленные перспективы применения технологий лейкофильтрации крови. Сообщение I. Лейкофильтрация — путь к вирусредукции. Вестник службы крови России,
№ 4, 2008, стр. 8-Ю.
      5. Суханов Ю. С, Рагимов А. А., Байрамалибейли И. 3., Токарев Ю. Н. Практические аспекты круговорота гемового железа. Вестник службы крови России, № 2, 2008, стр. 3-5.
      6. Ariga H., Tzong-Hae Lee, Leycock M. E. et al.
Residual WBC subsets in filtered prestorage RBC. Transfusion, V. 43, 2003, p. 98-106.

      7. Burnof Т., Radosevich M., Satoch S. et al. Nano-filtration of single plasma donations: feasibility study. Vok Sanguines, 2003, 84, 2.
      8. Gregori L., Mc Combie N.. Palmer D. et al. Effectiveness of leukoreduction for removal of infectivity of transmissible spongiform encephalopathies from blood. Lancet, 2004, 364 (9433), 529-531.
      9. Hammer J. H., Mynster Т., Reimert С V. et al. Reduction of bioactive substances in donor blood. Prestorage versus bedside leucofiltration. Eur. J. Haematol, 1999, 63, 29-34.
     10. Hebert P. S., Fergusson D., Blajchman M. A. et al. Clinical outcomes following institution of the Canadian universal leukoreduction program for red blood cell transfusions. JAMA, 2003, 289 (15), 1941-9.
      11. Mynster Т., Hammer J. H., Nielsen H. J. Prestorage and bedside leukofiltration of whole blood modulates storage time dependent suppression of in vitro TNF release. Br. J. Haematol., 1999, 106, 248-51.
      12. Nielsen H. J. Transfusion-Associated immunomodulation: Experimental Facts and Clinical Reality — New Perspectives. Transfus. Med. Hemother, 2006, 33, 324—329.
      13. Sirchia G., Giovanetti A. M. et al. Safe and good use of blood in surgery. Council of Europe Publishing, 1994, p. 1-235.
      14. Wenz В., Ciavarella D., Fredundlich L. Effect of prestorage white cell reduction on bacterial growth in platelet concentrates. Transfusion, 1993, 32, 663—666.